细胞工程

细胞工程细胞质工程研究真核细胞的核、质相互关系以及细胞器,胞质基因的转移等细胞拆合的技术,所以又叫细胞拆合工程

主要研究内容是细胞质的置换

过去在植物上置换的方法是进行连续回交

例如,为了研究柳叶菜属的细胞质遗传,曾连续回交了二十五代,结果还不能把全部母核替代出来

现在由于核移植和原生质体的分离方法的改进,推进了这项工程的进展

细胞质工程的方法去核和核移植  动物细胞核的移植一般都用显微操作器进行

50年代初期,美国生物学家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期细胞的细胞核移植到去核的蛙卵,并能正常发育

后来,英国J.B.格登把爪蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核卵内,能发育到有生殖能力的成体

中国童第周等还成功地进行金鱼类异种、异属之间的核移植实验(见细胞分化)

70年代以来,体外培养的动物细胞的去核,是先用细胞松弛素B处理细胞,再高速离心使细胞核与细胞质分开

分离出来的核,带有少量胞质并围有质膜,称为“核体”或“小型细胞”

核体能重新再生其胞质部分,继续生长、分裂

去核后的胞质部分,仍由膜所包围,即为“胞质体”或“去核细胞”(图3)

秋水仙素及其衍生物和长春新碱等也能诱发某些哺乳类细胞排核

目前制备胞质体和核体的方法目臻完善,纯度可达99%左右

胞质体约可存活18~36小时

植物细胞核的移植,在低等植物如单细胞伞藻,可把新鲜材料的假根切下,放在玻片上用玻棒挤压,使细胞的内含物压出在一滴适合的培养液中,反复冲洗几次,然后在显微镜下观察,一直到核周围无细胞质为止

离心分离后待用

高等植物如矮牵牛、天仙子、烟草、番茄等原生质体核的分离,可先在悬浮的原生质体中用蒸馏水将悬液冲淡一半,约30分钟后,原生质体破裂,放出细胞核与叶绿体,就可在0.6M蔗糖液中离心和收集核,然后存放在一定的培养液中待用

1978年以来又借用动物细胞去核的药剂细胞松弛素B来处理原生质体,加上高速离心,使原生质体分离成二部分,即:无核原生质体和小原生质体

开辟了去植物细胞核甚至去部分染色体的新途径

细胞重组已经分离的核体(小细胞)与胞质体在融合因子的介导下重新融合,构成“重组细胞”,这一技术即称为细胞重组,胞质体与另一完整细胞融合,即产生“胞质杂种”细胞

这两种细胞产生的效果是不同的,现在有方法把它们鉴别开

以大鼠二种成肌细胞为材料,一种是正常的具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT+)基因, 另一种是突变体缺少这种基因(HGPRT-),因此,前者细胞中有转移酶能被氚-次黄嘌呤标记,而后者没有这种酶,便不能标记

在两者的细胞质中让HGPRT+摄取小乳胶颗粒,让HGPRT-摄取大乳胶颗粒,以颗粒的大小来作标记

当核体(小型细胞)与胞质体融合后,在重组细胞中可看到核被氚-次黄嘌呤所标记,在细胞质中有大量大乳胶颗粒和极少数小乳胶颗粒

当胞质体与另一个HGPRT+完整细胞融合后的胞质杂种细胞的细胞质中,则同时出现有大量的大、小乳胶颗粒

如图4所示

应用这种方法很容易把两类细胞鉴别出来

在植物中,原生质体与核的融合以烟草、矮牵牛的核移植为例,其步骤是:①先使矮牵牛游离核与烟草原生质体各自悬浮并沉淀在0.25M硝酸钙溶液中,pH6;②去掉上清液,再把它们悬浮起来,以适当比例使核与原生质体在试管中混合、离心,随后加入45%聚乙二醇溶液1毫升使之聚合:③30分钟后,徐徐加入4毫升0.2M硝酸钙(被pH9的甘氨酸氢氧化钠所缓冲)以诱导融合摄取核;④15分钟后加0.2M硝酸钙(pH6);⑤再过20分钟,原生质体用培养液冲洗;⑥镜检后,将具有双核的(其中一个是矮牵牛的核)烟草原生质体进行培养

细胞质工程的应用动物方面1974年有人用两种小鼠成纤维细胞,其一用L细胞的完整细胞,它的核内具有对5-溴脱氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但细胞质内没有抗氯霉素的胞质基因,用的另一个细胞的线粒体上带有抗氯霉素的胞质基因CA(PR),而细胞核内带有硫代鸟嘌呤敏感核基因(TGS),把后者去核细胞与前者融合(图5),则融合后的胞质杂种细胞既能抗5-溴脱氧尿苷(BUdR),又能抗氯霉素(CAP)

但如果把亲体细胞 (BUdRR和TGS)同时培养在含有这两种药物的培养基上,则都将死去

因为这两种细胞一个对CAP敏感,另一个不抗BUdR,而胞质杂种细胞则两者都能抗,不但能存活而且还能增殖

植物方面用等渗密度梯度高速离心后,也可得到两种亚原生质体,①在低密度范围内可得到胞质体(去核原生质体);②在高密度中,可得到小原生质体(核质体)

现在已能自玉米、烟草和胡萝卜细胞得到这两种亚原生质体

生化实验证明:去核原生质体代谢作用很低,而小原生质体由于减少了表面积和体积(仅及原生质体的10~15%),因此,摄取物质快,合成蛋白质也快,培养时发育迅速,是一种研究核质关系的好材料

由于这项工作才开始,迄今尚无明显结果

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