水稻基因组计划基因组测序

水稻基因组计划基因组测序基因组测序涉及DNA的大规模测序,由于目前只能采取分而治之的测序基本策略,即将基因组DNA分割成一定大小的片段,然后分别对这些片段进行测序

而遗传图和物理图可作为整个基因组测序的路标,为小片段DNA测序和重叠群构建提供了基础

(一)遗传图谱自1988年McCouch等利用IR34583(籼)×BuluDalam(爪哇)的F2群体构建了第一张水稻分子连锁图谱(含135RFLP标记)以来,高密度的图谱相继产生

1991年,Tanksley等利用IRAT177(粳)/Apura(籼)DH群体构建了第二个RFLP分子连锁图谱;Saito等也构建了一张包含347个遗传标记的分子连锁图谱

1994年Causse等构建了另一张726个RFLP标记分子连锁图谱

Kurata等构建了一张包含1384个DNA标记的分子连锁图谱

中国的研究组也先后构建了一些遗传群体

近年来,随着分子遗传学的迅速发展,国际水稻基因组测序计划(InternationalRiceGenomeSequencingProject,IRGSP)成员国以Nipponbare、Kasalath、IR64和Azucena等水稻品种为材料,构建了10个饱和的遗传图谱并与表型的标记进行了整合,以创造新的遗传资源

1998年,Harushima等构建了一张高密度水稻遗传连锁图,包含了2275个遗传标记,覆盖水稻基因组1521.6cM

2001年,RiceGenomeProgram(RGP)公布了包含3267个RFLP分子标记的水稻分子连锁图

还利用次级三体和终级三体(telotrisomics)将经典遗传图和分子遗传图中的着丝粒位置确定,修正了分子图谱的方向,把RFLP标记定位到特定的染色体臂上;Wu等构建了水稻第11和第12染色体短臂末端重复基因组区域的图谱,重复基因组区域大小是2.5Mb,表明水稻也存在大染色体片段的重复区域

上述遗传图谱在基因定位、物理图谱的构建和基因测序中发挥了或即将发挥巨大作用

(二)物理图谱已获得高密度水稻遗传连锁图,为何不能直接指导基因组计划的测序,还要绘制物理图?其主要原因是遗传图的精确性较低、分辨率有限,而物理图是对遗传图的进一步深化,并能直接应用于图位克隆技术分离目的基因

1998年,Umehara等构建了水稻第一张物理图谱,共筛选到5701个YAC,其中2117个单一YAC分配到12条染色体上,跨度216Mb,覆盖水稻基因组的50%

接着日本水稻基因组计划(RGP)开始将YAC重叠群(contig)分解成粘粒(cosmid)DNA克隆,构建更精细的物理图谱

2001年,RGP还构建了一个覆盖270Mb(全基因组的63%)的YAC文库的物理图,由6934个YAC组成,插入片段平均长度为350kb

由于YAC克隆不太稳定、插入DNA难以分离、转化效率低等原因,美国Clemson大学基因组研究所(ClemsonUniversityGenomicsInstitute,CUGI)又建成了两个BAC库,一个是由37000个HindⅢ酶切的BAC文库,插入片段平均长度为128.5kb;另一个是有56000个克隆的EcoRⅠBAC库,插入片段平均大小为120kb,两者覆盖水稻基因组的26倍

1997年,中国科学院国家基因研究中心(NationalCenterforGeneResearch,NCGR)发表了由指纹?锚标法策略建成的含565个分子标记且覆盖率较高的水稻广陆矮4号基因组BAC库物理图

2001年,RGP为了克服YAC克隆的局限性,又以PAC为载体构建了水稻Nipponbare基因组文库,此文库由72000个Sau3AⅠ酶切克隆组成,平均插入片段长120kb,覆盖水稻基因组的16倍

RGP也对75000个PAC克隆进行了排列,所有已定位的可用标记用于鉴定和锚定PAC克隆

这些克隆分成3个池,以EST衍生的特异引物进行PCR排序,一个EST共有的几个PAC克隆被认为是重叠的,它们归为一个克隆群,这个方法可以解除由于杂交探针属于多基因家族而带来的困难

(三)基因组测序国际水稻基因组测序计划(IRGSP)由1997年在新加坡举行的植物分子生物学会议发起;1998年,中国、日本、美国和韩国的代表共同草拟了资源共享等组织议程;2000年在美国的C1emson召开了协调会,对12条染色体测序任务进行了分工(表1)

测序工作分为测序、填补缺口和最后完成三个阶段

对于最后测序结果的标准,IRGSP规定为误差率低于1/10000(精度99.99%)

第二阶段是测序工作的瓶颈,测序阶段留下的缺口需要补平,水稻特殊序列组成(易于形成二级结构和GC富集区)和重复序列造成的低质量测序结果需要改进

通过各研究机构和私营公司的共同努力,IRGSP已于2002年12月宣布,利用克隆连克隆(逐步克隆)测定法(clonebyclonesequencing),提前3年完成了水稻12条染色体的碱基测序工作

日本在其中发挥着主导作用,并最先以99.99%的精度完成了最长的第1条染色体的测序工作

此前,孟山都公司同意将已构建的水稻基因组序列草图(包括已构建物理图的3416个BAC和125619个STC序列)转让给IRGSP

RGP对原有的物理图进行延伸及弥补物理图上的空缺,大大加速了水稻基因组测序工作进程

中国科学家完成了第4染色体全长序列的精确测定

第1、4染色体的序列和结构已同时发表在2002年11月《Nature》第420期第312~320页

由美国Clemson大学负责的第10染色体的全长序列也已发表在2003年9月的《Science》上

其余各条染色体的测序结果也将陆续发表

另外,中国科学院基因组信息中心暨北京华大基因研究中心(简称基因信息中心)等12家单位,于1998年至2001年利用全基因组霰弹法(wholegenomeshotgunsequencing,WGS),构建了籼稻93-11基因组工作框架图和低覆盖率的培矮64S草图,并最先向全世界公布了水稻93-11全基因组框架图

随后,美国先正达(Syngenta)公司也完成了日本晴基因组工作框架图的测序

两个框架图同时发表在2002年4月的《Science》第296期第79~99页,它们都是对IRGSP的补充

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